在miRNA的研究中，验证miRNA与靶基因之间的关系是一个重要环节。miRNA通过其种子序列（5’端第2-8个碱基）靶向结合mRNA的3'UTR区域，进而诱导细胞内沉默复合体介导的mRNA降解或阻止其翻译过程。

基于这一原理，可以将目标基因的3'UTR（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase的下游。然后与miRNA模拟物共同转染目标细胞，添加底物，以检测荧光素酶活性的变化。如果荧光素酶活性下降，说明该miRNA与靶基因的3'UTR区域存在相互作用。

双荧光素酶报告基因检测的工作原理

双荧光素酶报告基因检测用于验证miRNA与靶基因3'UTR之间的相互作用，其主要步骤包括：

• 利用生物信息学工具（如TargetScan、StarBase和miRanda等）预测特定靶基因的3'-UTR区域是否带有miRNA结合位点。
• 将预测能够与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列插入到荧火虫荧光素酶（Firefly luciferase）的3'-UTR区域。
• 当miRNA与质粒中的插入序列结合时，miRNA将抑制荧光素酶的翻译，导致荧光值降低。

实验步骤与分析

通过上述步骤，双荧光素酶报告基因检测能有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，为研究miRNA功能及调控网络提供了重要工具。

尊龙凯时人生就博双荧光素酶报告基因检测服务流程

以下为详细操作步骤：

材料准备：

• 细胞：HEK293细胞或指定目标细胞
• 转染试剂：可选HieffTrans®invitrosiRNA/miRNATransfectionReagent
• 报告基因检测试剂盒：Dual Luciferease Reporter Gene Assay Kit
• 其他仪器耗材：酶标仪、细胞培养板等

实验步骤

1. 在目的细胞中进行转染实验，确认质粒瞬转效率，目标在40%以上为合格。
2. 准备单细胞悬液，接种于24孔培养板中， overnight 培养。
3. 当细胞覆盖率达到约70%时，进行转染实验。
4. 转染结束后，收集细胞样品并进行裂解。

结果检测

根据报告基因检测试剂盒的说明书操作进行检测。将裂解液离心，提取上清液进行荧光素酶活性测定。每个样品添加荧光素酶工作液，并设置空白对照。

实验预期结果

通过尊龙凯时人生就博提供的双荧光素酶报告基因检测服务，能够加快基础研究和药物筛选的进展！

相关产品清单