在之前发布的“叮咚！收下这份慢病毒包装的全攻略”和“慢病毒稳转细胞株的构建”两篇文章中，我们了解到了慢病毒作为一种强大的基因传递工具，能够有效地将外源基因整合到宿主染色体上，确保在体内长期表达。由于其对几乎所有哺乳动物细胞，包括干细胞和原代细胞的良好感染能力，慢病毒已经在生物医学研究中获得了广泛应用。那么，在获取包装好的慢病毒后，我们该如何进行下一步操作呢？今天，小医将为大家详细分享拿到慢病毒后的一系列操作步骤，内容充实，敬请关注！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后存放于-80℃冰箱，储存期限为半年。在超过半年后，建议在使用前重新测定滴度。若在短时间内（3-5天）进行实验，也可选择在4℃储存。此外，使用过程中应尽量避免频繁冻融，以免降低病毒滴度，因此建议根据每次实验的用量进行合理分装。

2. 病毒的稀释

如需稀释病毒，首先将病毒在冰浴中融化，然后可以用PBS或不含血清的培养基进行稀释，混匀后在4℃条件下保存。为了保证病毒滴度，建议在3天内用完。

3. 预实验摸索慢病毒的最佳MOI

鉴于不同细胞对慢病毒的敏感性各异，以及不同慢病毒载体荧光强度的差别，正式实验前应通过预实验确定慢病毒的感染复数（multiplicity of infection, MOI）和最佳的感染条件。这些条件包括接种细胞的数量、感染时的总体积以及感染后的换液时间，以确保正式实验能达到理想效果。在预实验中，第1天将生长状态良好的目的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO₂培养箱中过夜。第2天，根据文献或实验需求设置梯度的MOI值，一般在3-100范围内进行实验。

4. 慢病毒感染目的细胞

在确定合适的MOI后，可以进行正式感染实验。例如，利用带有GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞。步骤如下：(1) 第一天按实验需求将细胞以5-10×10⁴个/孔的密度铺板，37℃培养过夜。(2) 第二天，从-80℃冰箱取出病毒后进行冰浴融化，并根据预实验得到的MOI值用新鲜完整的培养基稀释病毒。(3) 吸去细胞原有的培养基，将调整过的病毒液加入细胞中，必要时可添加Polybrene以提高感染效率。(4) 感染后16-24小时，吸去含慢病毒的培养基，换成新鲜培养基。(5) 继续培养48-72小时后，根据需要收集细胞检测目的基因的表达。

5. 目的细胞稳转株的构建

成功感染后，通过抗生素筛选可以获得稳定表达目的基因的细胞株。抗生素浓度应在预实验中确定，以确保未感染细胞在抗性筛选压力下无法存活。定期更换含抗生素的培养基，直至未感染细胞被消灭。随后，可以进行多克隆及单克隆稳转株的筛选。对于多克隆稳转株，抗生素浓度应降低至维持浓度，继续对感染后的细胞进行筛选和扩增，并进行基因表达验证。在单克隆筛选中，通过稀释培养挑选单一细胞生长形成的克隆，以获得稳定表达的单克隆细胞株。最终，将鉴定结果正常的细胞进行冻存，确保细胞资源的有效利用。

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